Wie funktioniert die klassische Sanger-Sequenzierung?

Die klassische Sanger-Sequenzierung, auch als Kettenabbruch-Sequenzierung bekannt, ist eine Methode zur Bestimmung der Nukleotidsequenz von DNA. Hier sind die grundlegenden Schritte, wie sie funktioniert: 1. **DNA-Vorbereitung**: Die zu sequenzierende DNA wird isoliert und in kleinere Fragmente zerlegt, falls nötig. 2. **Primer-Hybridisierung**: Ein spezifischer Primer, der komplementär zu einem Teil der Ziel-DNA ist, wird hinzugefügt. Dieser Primer bindet an die DNA und dient als Startpunkt für die Synthese. 3. **DNA-Polymerase und Nukleotide**: Eine DNA-Polymerase wird hinzugefügt, zusammen mit den vier normalen Desoxynukleotiden (dATP, dTTP, dCTP, dGTP) und einer kleinen Menge der modifizierten, fluoreszenzmarkierten Didesoxynukleotide (ddNTPs). Diese ddNTPs sind Kettenabbrecher, da sie keine 3'-OH-Gruppe besitzen, die für die weitere DNA-Synthese notwendig ist. 4. **DNA-Synthese**: Die DNA-Polymerase beginnt, die DNA zu synthetisieren, indem sie die normalen Nukleotide hinzufügt. Wenn ein ddNTP eingebaut wird, stoppt die Synthese, da kein weiteres Nukleotid angefügt werden kann. 5. **Fragmentierung**: Dieser Prozess erzeugt eine Vielzahl von DNA-Fragmenten unterschiedlicher Längen, die jeweils an einem ddNTP enden. 6. **Trennung der Fragmente**: Die Fragmente werden durch Gelelektrophorese getrennt. Dabei wandern die kürzeren Fragmente schneller durch das Gel als die längeren. 7. **Detektion**: Die Fragmente werden dann detektiert, oft durch fluoreszierende Signale, die von den ddNTPs ausgehen. Ein automatisierter Sequenzierer liest die Fluoreszenzsignale und bestimmt die Reihenfolge der Nukleotide. 8. **Datenanalyse**: Die gesammelten Daten werden analysiert, um die genaue Sequenz der DNA zu bestimmen. Diese Methode ist sehr präzise und wurde lange Zeit als Goldstandard in der DNA-Sequenzierung verwendet.