Das Eisen in der Hämgruppe muss oxidiert werden, um seine Oxidstufe zu verändern, was die Bindungsaffinität und die elektronischen Eigenschaften des Hämoglobins beeinflusst. In der reduzierten Form (Fe²⁺) kann das Eisen Sauerstoff binden, aber die Absorptionseigenschaften sind in dieser Form nicht optimal für die spektroskopische Analyse. Durch die Oxidation des Eisens zu Fe³⁺ wird die Hämgruppe stabiler und die Bindung an Cyanid (CN⁻) ermöglicht die Bildung eines stabilen Komplexes. Cyanid hat eine hohe Affinität zu Fe³⁺ und bildet einen farbigen Komplex, dessen Absorption im sichtbaren Bereich gemessen werden kann. Diese Absorption ist wichtig für die quantitativen Analysen, da sie eine klare und messbare Veränderung im Spektrum erzeugt, die zur Bestimmung der Konzentration des Hämoglobins oder anderer verwandter Verbindungen verwendet werden kann.