Vor der Durchführung einer PCR (Polymerase-Kettenreaktion) gibt es mehrere wichtige Berechnungen, die du berücksichtigen musst: 1. **Konzentration der DNA-Vorlage**: - Bestimme die Konzentration der DNA-Vorlage, die du in der PCR verwenden möchtest. Dies kann durch Messung der Absorption bei 260 nm (A260) mit einem Spektralphotometer erfolgen. - Berechne die benötigte Menge an DNA in ng oder µg, basierend auf der gewünschten Endkonzentration in der PCR-Reaktion. 2. **Primer-Konzentration**: - Berechne die Menge an Primern, die du hinzufügen musst, um die gewünschte Endkonzentration (typischerweise 0,1-1 µM) zu erreichen. - Beispiel: Wenn du eine 10 µM Primer-Lösung hast und eine Endkonzentration von 0,5 µM in einem 50 µL PCR-Ansatz benötigst, dann benötigst du 2,5 µL der Primer-Lösung. 3. **dNTP-Konzentration**: - Berechne die Menge an dNTPs, die du hinzufügen musst, um die gewünschte Endkonzentration (typischerweise 200 µM jedes dNTPs) zu erreichen. - Beispiel: Wenn du eine 10 mM dNTP-Mischung hast und eine Endkonzentration von 200 µM in einem 50 µL PCR-Ansatz benötigst, dann benötigst du 1 µL der dNTP-Mischung. 4. **Puffer-Konzentration**: - Berechne die Menge des PCR-Puffers, die du hinzufügen musst, um die gewünschte Endkonzentration (typischerweise 1x) zu erreichen. - Beispiel: Wenn du einen 10x PCR-Puffer hast und eine Endkonzentration von 1x in einem 50 µL PCR-Ansatz benötigst, dann benötigst du 5 µL des 10x Puffers. 5. **MgCl2-Konzentration**: - Berechne die Menge an MgCl2, die du hinzufügen musst, um die gewünschte Endkonzentration (typischerweise 1,5-2,5 mM) zu erreichen, falls der Puffer dies nicht bereits enthält. - Beispiel: Wenn du eine 50 mM MgCl2-Lösung hast und eine Endkonzentration von 2 mM in einem 50 µL PCR-Ansatz benötigst, dann benötigst du 2 µL der MgCl2-Lösung. 6. **Taq-Polymerase**: - Berechne die Menge der Taq-Polymerase, die du hinzufügen musst, basierend auf der empfohlenen Menge pro Reaktion (typischerweise 0,5-1,25 Einheiten pro 50 µL Reaktion). 7. **Gesamtvolumen**: - Stelle sicher, dass das Gesamtvolumen der PCR-Reaktion (typischerweise 50 µL) korrekt ist, indem du die Volumina aller Komponenten addierst und mit Wasser auffüllst. Ein Beispiel für eine typische 50 µL PCR-Reaktion könnte so aussehen: - DNA-Vorlage: 1 µL - Forward Primer (10 µM): 2,5 µL - Reverse Primer (10 µM): 2,5 µL - dNTP-Mischung (10 mM): 1 µL - 10x PCR-Puffer: 5 µL - MgCl2 (50 mM): 2 µL - Taq-Polymerase: 0,5 µL - Wasser: 35,5 µL Diese Berechnungen helfen dir sicherzustellen, dass alle Komponenten in den richtigen Konzentrationen vorliegen, um eine erfolgreiche PCR durchzuführen.