Wozu dient das Aufkochen der Proben bei 95 °C bei der SDS-PAGE Vorbereitung?

Das Aufkochen der Proben mit Probenpuffer bei 95 °C in der Vorbereitung einer SDS-PAGE dient mehreren Zwecken:

1. **Denaturierung der Proteine**: Die Hitze hilft, die Proteine zu denaturieren, das heißt, ihre natürliche Faltung wird aufgebrochen. Dies ist wichtig, um sicherzustellen, dass die Proteine in einer linearen Form vorliegen, was eine gleichmäßige Wanderung durch das Gel ermöglicht.

2. **Lösen von Aggregaten**: Durch die Hitze werden Proteinaggregate aufgelöst, sodass die Proteine als einzelne Polypeptidketten vorliegen.

3. **Aktivierung des SDS**: Der Probenpuffer enthält in der Regel SDS (Natriumdodecylsulfat), ein Detergens, das die Proteine mit einer negativen Ladung versieht. Die Hitze unterstützt die Bindung des SDS an die Proteine, was zu einer gleichmäßigen negativen Ladung pro Masseeinheit führt.

4. **Reduktion von Disulfidbrücken**: Oft enthält der Probenpuffer auch ein Reduktionsmittel wie DTT (Dithiothreitol) oder β-Mercaptoethanol, das Disulfidbrücken in den Proteinen reduziert. Die Hitze beschleunigt diesen Prozess.

Durch diese Schritte wird sichergestellt, dass die Proteine in der SDS-PAGE nach ihrer Größe und nicht nach ihrer Form oder Ladung getrennt werden.