2 Fragen zu Probenpuffer

Um das Volumen der Probe zu ermitteln, das du mit 40 Mikrogramm Protein und 3 Mikrolitern 5x Probenpuffer mischen möchtest, um ein Gesamtvolumen von 15 Mikrolitern zu erreichen, kannst du die folgende Berechnung durchführen: 1. **Gesamtvolumen**: 15 Mikroliter 2. **Volumen des Puffer**: 3 Mikroliter 3. **Volumen der Probe**: Gesamtvolumen - Volumen des Puffers Das bedeutet: Volumen der Probe = 15 Mikroliter - 3 Mikroliter = 12 Mikroliter Du musst also 12 Mikroliter der Probe (mit 40 Mikrogramm Protein) zu 3 Mikrolitern des Puffers hinzufügen, um ein Gesamtvolumen von 15 Mikrolitern zu erhalten.

Das Aufkochen der Proben mit Probenpuffer bei 95 °C in der Vorbereitung einer SDS-PAGE dient mehreren Zwecken: 1. **Denaturierung der Proteine**: Die Hitze hilft, die Proteine zu denaturieren, das heißt, ihre natürliche Faltung wird aufgebrochen. Dies ist wichtig, um sicherzustellen, dass die Proteine in einer linearen Form vorliegen, was eine gleichmäßige Wanderung durch das Gel ermöglicht. 2. **Lösen von Aggregaten**: Durch die Hitze werden Proteinaggregate aufgelöst, sodass die Proteine als einzelne Polypeptidketten vorliegen. 3. **Aktivierung des SDS**: Der Probenpuffer enthält in der Regel SDS (Natriumdodecylsulfat), ein Detergens, das die Proteine mit einer negativen Ladung versieht. Die Hitze unterstützt die Bindung des SDS an die Proteine, was zu einer gleichmäßigen negativen Ladung pro Masseeinheit führt. 4. **Reduktion von Disulfidbrücken**: Oft enthält der Probenpuffer auch ein Reduktionsmittel wie DTT (Dithiothreitol) oder β-Mercaptoethanol, das Disulfidbrücken in den Proteinen reduziert. Die Hitze beschleunigt diesen Prozess. Durch diese Schritte wird sichergestellt, dass die Proteine in der SDS-PAGE nach ihrer Größe und nicht nach ihrer Form oder Ladung getrennt werden.