Carboxylasen sind Enzyme, die CO₂ in organische Moleküle einfügen, jedoch können sie nicht direkt HCO₃⁻ (Bicarbonat) zur Carboxylierung verwenden, weil Bicarbonat in einer stabilen ionischen Form vorliegt, die nicht reaktiv genug ist, um direkt an die Carboxylierung zu partizipieren. Ein Enolat kann kein Bicarbonat attackieren, da die nucleophile Attacke auf das Bicarbonat durch die Stabilität des Bicarbonat-Ions und die energetischen Barrieren, die mit der Umwandlung von HCO₃⁻ in ein reaktiveres CO₂ verbunden sind, behindert wird. Enolate sind zwar starke Nucleophile, benötigen jedoch ein reaktives Kohlenstoffatom, um eine effektive Reaktion durchzuführen. CO₂ ist in diesem Kontext reaktiver als HCO₃⁻, was die Verwendung von CO₂ in der Carboxylierung begünstigt. Zusammengefasst: Die Stabilität von HCO₃⁻ und die energetischen Barrieren hindern eine direkte Reaktion mit Enolaten, weshalb CO₂ als Carboxylierungssubstrat bevorzugt wird.